PCR實驗設計引物詳述

PCR (polymerase chain reaction)聚合酶鏈式反應，又稱體外DNA擴增技術可以將微量目的DNA片段擴增一百萬倍以上。PCR的原理在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點，通過變性、退火、延伸等步驟，體外復制出與母鏈模板DNA互補的子鏈DNA的過程。
聚合酶鏈式反應用于擴增一小段已知的DNA片段，可能是單個基因，或者僅僅是某個基因的一部分。與活體生物不同的是，PCR只能復制很短的DNA片段，通常不超過10kbp。DNA是雙鏈分子，因此用互補DNA雙鏈的構造單位（核苷酸）來度量其大小，單位為堿基對（base pair, bp）。

下面詳述PCR設計引物：

一、PCR設計引物前應的準備工作：
1．準備載體圖譜，大致準備把片斷插在那個部分
2．對片斷進行酶切分析，確定一下那些酶切位點不能用
3．準備一本所買公司的酶的商品目錄，便于查酶的各種數據及兩種酶是否可以配用

二、引物的結構：
5’—保護堿基+酶切位點+引物配對區—3’
1．兩個酶切位點
2．酶切位點的保護堿基
3．5’端保護堿基
4．3’端保護堿基
5．引物配對區

三、PCR引物設計原則：
引物設計有3 條基本原則：
首先引物與模板的序列要緊密互補；
其次引物與引物之間避免形成穩定的二聚體或發夾結構；
再次引物不能在模板的非目的位點引發DNA 聚合反應(即錯配)。
PCR反應中有兩條引物，即5′端引物和3′引物。設計引物時以一條DNA單鏈為基準（常以信息鏈為基準），5′端引物與位于待擴增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物與位于待擴增片段3′端的一小段DNA序列互補。

1. 引物設計基本原則
1）、引物長度：18-26bp，可放寬至18-30bp（有研究表明超過30bp再增加引物長度意義不大）；
2）、引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C 過多易出現非特異條帶。ATGC最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列存在；
3）、引物Tm：54-58℃，可放寬至52～62℃，GC%>60%可進一步放寬；
4）、擴增子Tm：>92℃；
5）、3'端：優選三聯體WSS、SWS、TTS，二連體GC，單體S，盡量規避WWW、CGW、GGG、CG；
6）、引物與非特異擴增區的序列的同源性不要超過70%，引物3′末端連續8個堿基在待擴增區以外不能有完全互補序列，否則易導致非特異性擴增；
7）、末端2bp最好為GC；
8）、引物的5′端可以修飾。如附加限制酶位點，引入突變位點，用生物素、熒光物質標記，加入其它短序列，包括起始密碼子、終止密碼子等；
9）、其他：避免3'端8bp及以上序列與模板多位點互補，盡量避免上下游3'端4bp及以上反向互補，盡量避免內部回文。

基于上述原則，在實踐分兩種情況中應用：
1、基因克隆PCR引物設計
這種情況我們往往并沒有太多選擇，只能從ATG開始，從TAA等結束，什么GC%、二聚體和錯配，可能根本由不得我們。既然起點定了，那只能通過改變長度來匹配最優設計要求了。
2、鑒定PCR引物設計
我們只需要確認一段DNA序列上的一部分，起點是相對的，我們可以在整個序列范圍內搜索，引物設計的靈活性大大提高，當然搜索時間也要增加。

四、設計引物所要考慮的問題
1．酶切位點
兩個酶切位點應是載體上的，所連接片斷上沒有這兩個位點，且距離不能太近，否則往往導致兩個酶都切不好。因此，兩個酶切位點要緊挨在一起，只能切一個，除非恰好是與上面兩個酶在一起的酶切位點，最好隔四個核苷酸。且不能有堿基的交叉，比如AGATCTTAAG，這樣的位點比較難切。
2．酶的選擇
最好使用雙酶切效率高的，但兩個酶切點最好不要是同尾酶（切下來的殘基不要互補），否則效果相當于單酶切，最好使用具有共同buffer，且較常用的酶（如hind3，bamh1，ecor1等），這樣可以省錢。
3．Tm的計算
Tm是由互補的DNA區域決定的，而不互補的區域對DNA的溶解是沒有作用的。因此，對于引物的Tm，只有和模板互補的區域對Tm才有貢獻。計算Tm時，只計算互補的區域（除非你的酶切位點也與模板互補）。設計引物的時候，先不管5'端的修飾序列，把互補區的Tm控制在55度以上（我喜歡控制在58以上，具體根據PCR的具體情況，對于困難的PCR，需要適當提高Tm），再加上酶切位點和保護堿基，這樣的引物通常都是可用的，即使有小的問題，也可以挽回。
Tm溫度高的引物就比較容易克服3’發卡、二聚體及3'非特異結合等問題。簡單的計算公式可以用2+4的公式。若你計算的Tm值達到了快90 ，不包括酶切位點。引物公司給你發的單子是包括酶切位點的。自己可以再估計一下。如你設計了帶酶切位點的引物，總長分別為29、33個堿基，去掉酶切位點和保護堿基，分別為17、21個堿基。引物公司給的單子是70多度，實際用的只有50度，用55度擴的結果也差不多。
其它關于Tm值的計算，有用PP5.0進行評價的，需要考慮base number、GC%、Tm、hairpin、dimer、false priming、cross dimer等參數。
4．退火溫度
退一般退火溫度為Tm-5度，退火溫度的計算可以不把加入的酶切位點及保護堿基考慮進去， PCR幾個循環后，引物外側的序列已經參入了擴增片斷中，所以你可以在預變性后多加幾步，溫度比你Tm值低些（這樣可能會增加非特異性），Tm值是你包括酶切位點及保護堿基的Primer計算出來的。
5．5’端保護堿基
一般在5'端加保護堿基,如果你擴增后把目的條帶做膠回收轉入T-VECTOR或者其它的載體的話,酶切時可以不需加保護堿基
6．引物二聚體
關于引物二聚體，最好用primer或是其他設計引物的軟件進行計算一下，看看引物之間的△G（自由能）的絕對值，如果小于10，一般是問題的。如果稍大，PCR時可以提高一下退火溫度，一般是沒有問題的。如果3’端形成二聚體，并且自由能絕對值較大，如果 PCR沒有條帶，建議重新設計引物。此外，所加的三個核苷酸的保護序列經過盡心設計有時也可以降低二聚體的△G。
7．引物的設計
在設計酶切位點時，最好能盡可能多的利用引物本身的堿基。這是因為，一個特異性引物一般都是20bp左右，再加上酶切位點序列和保護性堿基，大致就是28bp左右了。而我們在設計退火溫度時，與引物的長度有關，比正常的引物(20bp) 的Tm肯定要高一些。如果我們能利用引物自身的部分序列，就可以有效地減少引物的長度。
還有，有些酶是離不開末端序列的，因此，在設計一個酶位點時，最好把該酶的性質弄清楚。設計時限制性酶切位點是應該在5’端的頂端。在設計引物時，常在5’端添加酶切位點，以利于PCR產物連接到載體。
設計引物時保證在最后5個核苷中含有3個A或T。先用軟件設計出合適的引物，引物的3’端是引發延伸的起點，因此一定要與模板準確配對，應盡量避免在引物3’端的第一位堿基是A（容易錯配）。引物3’端最佳堿基的選擇是G和C，因為他們形成的堿基配對比較穩定，目的序列上并不存在的。