實驗中抗體應用全面講解

     抗體是一種由漿細胞（效應B細胞）分泌，被免疫系統用來鑒別與中和外來物質如細菌、病毒等的大型Y形蛋白質，僅被發現存在于脊椎動物的血液等體液中，及其B細胞的細胞膜表面。抗體能識別特定外來物的一個獨特特征，該外來目標被稱為抗原。實驗中抗體應用全面講解：

一、WB（Western Blot ）蛋白免疫印跡雜交 ： 是將蛋白樣本通過聚丙烯酰胺電泳按分子量大小分離，再轉移到雜交膜（blot）上，然后通過一抗/二抗復合物對靶蛋白進行特異性檢測的方法。

二、IHC /ICC（Immunohistochemistry/Immunocytochemistry ）免疫組織/細胞化學是應用免疫學基本原理--抗原抗體反應，即抗原與抗體特異性結合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑 （熒光素、酶、金屬離子、同位素） 顯色來確定組織細胞內抗原（多肽和蛋白質），對其進行定位、定性及定量的研究

三、IF （Immunofluorescence ）免疫熒光：是在免疫學、生物化學和顯微鏡技術的基礎上建立起來的一項技術。它是根據抗原抗體反應的原理，先將已知的抗原或抗體標記上熒光基團，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢查細胞或組織內的相應抗原（或抗體）。利用熒光顯微鏡可以看見熒光所在的細胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質和定位，以及利用定量技術（比如流式細胞儀）測定含量。 ICC通過酶反應顯色，IF主要測熒光；用的抗體和識別的表位是一樣的，做法幾乎一樣。只是標記二抗不一樣。

1. 做流式的抗體和免疫組化的抗體是一樣的嗎?

不一定能通用。流式是用直接標記還是間接標記?如果是直接標記的話，那這個抗體一般不是FITC標記或者就是TRITC，PE之類的。如果恰好你的免疫組化，也是想用熒光素標記的抗體來直接標記，那就可以通用。如果你的免疫組化要用其它的標記的話，或者是間接標記的話，就有麻煩，因為熒光素的標記很可能會影響二抗和一抗的結合。

2. 為什么我的抗體做WB非常好，而做不了IF，IHC等其他任何實驗?

首先恭喜你有一個WB非常好的抗體，畢竟能獲得做WB非常好的抗體也不容易。其次，你這個抗體很可能是通過人工合成多肽得到的，和上面所述，你用來做抗原的多肽恰好被包埋在蛋白質的中心，因此只能識別WB中線性的部分。

3. 如何選擇免疫組化抗體?

首先，一抗是選擇單克隆抗體還是多克隆抗體，單克隆抗體特異性強，靈敏度低;多克隆抗體靈敏度高，特異性弱。根據你的實驗結果，如果非特異多，那么選擇單克隆抗體;如果陽性信號弱，不妨選擇多克隆抗體試試。一般家兔來源的都是多克隆，小鼠來源的是單克隆。其次是要弄明白該一抗能夠識別什么種屬的抗原，抗體說明書上面一般注明有，比如小鼠Mus, 大鼠Rat, 人Hum。再次比較重要的是要注意一抗的來源。比如我們在人的癌組織中做p53的免疫組化，一抗我們采用的是小鼠來源的p53抗體，那么二抗我們一定要選擇抗小鼠的二抗比如(山羊抗小鼠，兔抗小鼠)，這一點非常重要。最后，一般的抗體說明書都會注明能做什么實驗，如果標明了不可以做免疫組化，一定不要選擇;反過來說，即使標明了可以做免疫組化，也不一定能夠做，商家只會夸大其效果。

4. WB和IF的二抗是一樣的嗎?

很明顯，不是!免疫熒光抗體是用于 免疫熒光試驗的，是用FITC或PE等標記的抗體，結果需要紫外線激發并用熒光顯微鏡觀察WB抗體一般是HRP或堿性磷酸酶等標記的抗體，需顯色底物(如OPDTMB等)直接顯色(肉眼)或化學發光法顯影(需特殊儀器)。

5. 做CHIP的抗體是否可以用來做WB抗體?

不一定，一般來說做CHIP級別的抗體對抗體純度特異性方面都要求比較高，基本上能做CHIP的抗體都可以做WB。但是如果CHIP的抗體識別的是構象表位(比如是由兩個實際靠在一起但變為線性結構之后相隔很遠的兩端序列)，而不是線性表位，這種CHIP抗體做不了WB。

6. 抗體說明書上面沒有寫該抗體能夠用于某項實驗怎么辦?

一般而言，抗體研發出來之后都要經過WB，IP，IF，IHC實驗。檔發現濃度不夠做IF，IHC時候，國外的抗體一般都是寫未檢測，國內的抗體一般是不寫。所以盡量不要抱著試試的心里去嘗試，往往只會浪費時間。你想啊，如果抗體能夠做該實驗，他們肯定會寫上去啊。

7. 做ELISA的抗體能否用來做WB?

通常用WB抗體稀釋濃度為1:1000，IF/IHC為1:100，而如果可以做ELISA則可以稀釋1:10000。如果一個抗體用來做ELISA的，那么言外之意就是該抗體效價不高。但不是說ELISA的抗體不能用于做WB，抗體說明書提示做ELISA稀釋比例為1:1000，那么你可以試試1:100做做WB。