ELISA實驗假假陽性結(jié)果分析

 ELISA是酶聯(lián)接免疫吸附劑測定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的簡稱。它是繼免疫熒光和放射免疫技術(shù)之后發(fā)展起來的一種免疫酶技術(shù)。ELISA被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)、食品安全等領(lǐng)域，是一種靈敏度高、特異性強、操作簡便的檢測方法。在實際應(yīng)用中，ELISA操作的各個方面均對結(jié)果產(chǎn)生影響，如移液器的使用、樣本存放、加樣、溶血、試劑溫度等。除此之外，一些非主觀因素也會對結(jié)果造成較大的偏差。

ELISA實驗假假陽性結(jié)果分析：

一、內(nèi)源性因素

1、年齡因素

老年人容易出現(xiàn)免疫功能異常，產(chǎn)生一些異常蛋白質(zhì)干擾了檢測的結(jié)果出現(xiàn)假陽性。

2、疾病因素

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡、糖尿病、自身免疫性疾病等可使患者體內(nèi)含有嗜異性抗體，自身抗體、類風(fēng)濕因子等，這些特殊成分在反應(yīng)過程中有一定的吸附作用，多為體內(nèi)某些抗原物質(zhì)干擾所致產(chǎn)生假的顯色反應(yīng)而出現(xiàn)假陽性。

二、標(biāo)本因素

1、標(biāo)本處理不徹底

血液抽出后未完全凝固而離心分離血清不能使纖維蛋白原完全析出，加樣后板孔中形成纖維蛋白薄膜或絮狀物，造成洗板不徹底干凈，酶殘留在反應(yīng)孔中，使反應(yīng)孔吸光度值偏高，出現(xiàn)假陽性，待測血清中混有纖維蛋白原，這種物質(zhì)易沉淀或附著在聚乙烯孔內(nèi)不易洗凈，試驗表明在較高的離心轉(zhuǎn)速（3000/min）和較長的離心時間（>10/min）之上，血液標(biāo)本被充分地離心分離后，使紅細胞和纖維蛋白充分沉淀，可以在加樣時避免加入這兩種干擾物質(zhì)對試驗結(jié)果的影響。

2、標(biāo)本溶血

標(biāo)本溶血時細胞內(nèi)液的各種活性酶以及具有酶活性的物質(zhì)與底物非特異性結(jié)合，洗滌時不易洗去，催化底物產(chǎn)生一定的顯色反應(yīng)，使本底吸光度值偏高形成假陽性。

3、細菌污染

標(biāo)本放置、處置不當(dāng)被細菌污染，一些細菌體內(nèi)可能含有內(nèi)源性辣根過氧化物酶會對相應(yīng)的酶做標(biāo)記的測定方法產(chǎn)生非特異性干擾，造成弱的假陽性反應(yīng)。

三、操作因素

1、加 樣

對于間接ELISA標(biāo)本一般都要進行稀釋，如果加樣不準(zhǔn)就會造成誤差，尤其當(dāng)稀釋倍數(shù)大時，很小的誤差，會導(dǎo)致較大的相對誤差，使陰性（或弱陽性）標(biāo)本呈陽性（或陰性）。加樣時應(yīng)將所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。目前，大部分血站都已使用全自動酶免加樣系統(tǒng)處理標(biāo)本，可較好地避免以上誤差。

2、洗 滌

在ELISA中正確的洗滌是保證得到可重復(fù)結(jié)果的關(guān)鍵一步，應(yīng)引起操作者重視。無論是手工操作還是機器操作，得出不正確的結(jié)果常與不正確的洗滌有關(guān)，ELISA就是靠洗滌來達到分離游離和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。通過洗滌以消除殘留在板孔中沒能與固體抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)，以及在反應(yīng)過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。

干貨 | 洗板——直接影響ELISA結(jié)果！

3、溫 育

每種試劑都有其最合適的反應(yīng)模式，其中溫度和溫育時間控制是重要因素。因孵育溫度高，反應(yīng)時間長，會造成整板本底高，陽性率高。溫育一般用濕盒或水浴，反應(yīng)板不宜疊放，以保證各板溫度都能迅速平衡，為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋。

四、儀器因素

1、酶標(biāo)儀

作為記錄測定結(jié)果的儀器，酶標(biāo)儀的性能穩(wěn)定與否，決定結(jié)果的可靠度。首先酶標(biāo)儀應(yīng)定期進行保養(yǎng)，對濾光片要定期校正；其次酶標(biāo)儀波長設(shè)置要正確，最好使用雙波長，一個檢測波長，一個參比波長，以消除微孔板底部劃痕、不平、指印或液面高度差異造成的光干擾。此外，在用酶標(biāo)儀讀數(shù)時最好先擦拭微孔板底部并壓平板條。由于各種酶標(biāo)儀性能有所不同，使用中應(yīng)詳細閱讀說明書

2、波長選擇

酶標(biāo)儀的波長選擇，建議酶標(biāo)儀比色時選擇雙波長，即敏感波長（主波長）和非敏感干擾波長（次波長），最后從儀器上得到的讀數(shù)為敏感波長與非敏感干擾波長之差，排除（板孔的劃痕、污跡）干擾。

五、方法學(xué)因素

1、試劑盒選擇

由于不同廠家的試劑盒所包被的抗原配比以及抗原純度不盡一致，造成靈敏度和特異性不同，因此也造成了假陽性或假陰性的產(chǎn)生。實驗中，不同廠家的ELISA試劑盒不要混用。

2、實驗灰區(qū)

在陽性與陰性之間有一條明顯的分界線，作為陽性判定值（cut-off）來判定結(jié)果，一般把檢測值S/COV值（樣本吸光度值比臨界值）在0.6-1范圍內(nèi)時作為灰區(qū)帶，因此當(dāng)1＜S /CO≤0.6時，真反應(yīng)性顯色的可能性小，多為體內(nèi)某些抗原物質(zhì)干擾所致，實驗室檢測人員應(yīng)依據(jù)實驗檢測結(jié)果，結(jié)合受檢者相應(yīng)病史和個體狀況進行綜合分析，應(yīng)進行確認(rèn)實驗，避免判定假陽性。

3、鉤狀效應(yīng)

鉤狀效應(yīng)即HOOK效應(yīng),是指由于抗原抗體比例不合適而導(dǎo)致假陰性的現(xiàn)象，其中抗體過量叫做前帶效應(yīng)；抗原過量叫做后帶效應(yīng)。鉤狀效應(yīng)的產(chǎn)生，需對標(biāo)本進行稀釋重復(fù)檢測。

多種因素可能會導(dǎo)致ELISA法本底偏高。出現(xiàn)灰值，除了嚴(yán)格操作、做好質(zhì)控，對可疑假陽性的標(biāo)本一定要認(rèn)真復(fù)測外。選擇有品牌知名度(國際高影響因子雜志文章使用)，有質(zhì)量保障(嚴(yán)格質(zhì)量品控)、有優(yōu)質(zhì)的售后服務(wù)(專業(yè)技術(shù)服務(wù)團隊)、高性價比(國際品質(zhì)&特惠價格) 的ELISA試劑盒來避免假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。