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細胞培養過程被微生物污染探究
細胞培養是指將細胞從動物或植物體內取出，然后在適宜的人工環境中生長的過程。細胞可以在培養前直接從組織中取出并通過酶或機械方法進行解離，也可以來源于已建立的細胞系或細胞株。細胞常規培養是在細胞房中進行，在超凈工作臺或生物安全柜中，把細胞處理好，根據需要加入細胞培養基，放入細胞培養瓶/皿或細胞培養板中，再放到帶有5% CO2 的37℃恒溫培養箱中培養。
微生物污染情況詳述如下：
由于體外培養的細胞自身沒有抵抗污染的能力，而在培養基中加抗生素的抗污染能力也是有限的，因而細胞微生物污染一旦發生往往是無法挽救的。一般在細胞受到污染早期或污染較輕時，能及時處理并除去污染物，部分細胞還有可能得到挽救。
不同的微生物污染物對細胞的影響也有差別，微生物中支原體和病毒對細胞形態和技能的影響是長期的，緩慢的和潛在的。而霉菌和細菌增殖迅速，能在很短的時間內抑制細胞生長或產生有毒物質殺滅細胞。
1、霉菌污染
種類很多，污染的多是曲霉菌，白色念珠菌，酵母菌，黑霉菌，孢子菌等。霉菌污染后多數在培養液中形成淡黃色或是白色的漂浮物，一般肉眼可見，較易被發現，短期內培養液多不變混濁。倒置顯微鏡下可以看見細胞之間有縱橫交錯穿行的絲狀，樹枝狀或管狀菌絲，并漂浮在培養液中。很多菌絲在高倍鏡下可以看見鏈狀排列的菌株。念珠菌及酵母菌菌株呈卵圓形，散在細胞上及細胞周邊生長。
處理：確認是霉菌污染，如果細胞種類不是特別珍貴，直接放棄，并將實驗環節消毒。
2、細菌污染
細菌污染較常見的有大腸桿菌，白色葡萄球菌，假單孢菌等。加用抗菌素的培養液可預防和排除個別一般少量細菌的污染。一旦發生細菌污染很容易發現，多數情況下培養液短時間內變黃，表明有大量酸性物質產生，出現明顯渾濁現象；有時靜置的培養液起初不混，但稍加震蕩，就有許多混濁物漂起。倒置顯微鏡下觀察，可見培養液中有大量圓球狀顆粒物漂浮，有時在細胞表面及周圍有大量細菌存在，細胞停止生長并有中毒表現。必要時可取少量培養液涂片染色檢查以明確細菌種類；有的培養液改變不明顯而有疑似污染，亦可向肉湯培養基內陸入少量培養液，37℃培養以檢測。
處理：一般用抗生素的常用量的5~10倍作沖擊療法，用藥24~48小時后再換常規培養液，有時在早期污染時此法有效。細胞培養中用抗生素多為預防細菌污染，一半多聯合應用。一旦發生污染后再使用抗生素常常難以除掉，有的抗生素只有抑菌作用而無殺菌效應。
3、支原體污染
支原體是一種大小介于細菌和病毒之間(最小直徑0.2um)并獨立生活的微生物.約有1%可通過濾菌器。支原體無細胞壁形態呈高度多形性.可為圓形、絲狀或梨形。
支原體形態多變，在光境下不易看清內部結構。多數支原體適合于偏堿條件下生存(PH7.6-8.0)，對酸耐受性差。對熱比較敏感，對一般抗生素不敏感。
支原體污染細胞后.培養液可不發生混濁.多數情況下細胞病理變化輕微或不顯著，細微變化也可由于傳代、換液而緩解.因此易被忽視。但個別嚴重者，可致細胞增殖緩慢.甚至從培養器皿脫落。為確定有無支原體污染可做如下檢測：
a:相差顯微境檢測；b:熒光染色法；c:電鏡檢查；d:DNA分子條文檢查或支原體培養等方法。處理：市場上有多種支原體清除試劑盒，效果比較好。
4、酵母污染
酵母到處存在，并能在合適的環境中快速生長。酵母污染很容易觀察到，培養物變渾濁，尤其在后期。一般PH值變化很小，嚴重時，PH值升高。顯微鏡下呈卵圓形或球形顆粒，有些會芽生較小顆粒。
5、病毒污染
組織細胞培養過程中，如果沒有除去潛在的病毒，就會產生病毒污染。目前，從原代猴腎細胞的培養中已發現不少于20種血清性病毒。
盡管病毒污染的細胞不影響原代培養，但生產疫苗是不安全的。因此，潛在病毒是細胞大量生產和疫苗、干擾素等生物制品制作中的難題。
6、細胞交叉污染
細胞污染和細菌污染不同，細胞污染是由于在培養過程中各種細胞同時進行，而所用器具或液體混雜使用所致。這種污染沒有微生物存在，但使培養細胞不同種類之間發生混亂，細胞生長特性，形態發生變化。有些變化輕微，不易察覺，有些則可能由于污染的細胞具有生長優勢而最終壓過原來細胞而導致細胞生長的抑制，最終死亡。污染過的細胞由于種類不純，無法進行實驗研究。
7、預防污染方法
需要考慮的注意事項：
1、進入培養間時，保持雙手潔凈。使用肥皂全清洗后，酒精干燥(不用紙巾)；
2、佩戴手套(保證手套可以被消毒)；
3、穿著帶有松緊袖口的實驗服；
4、不要隨便觸碰無關物品(例如：電話、門把手、甚至說是整理頭發等)；
5、避免佩戴手表、戒指和其他首飾；
6、脫去在其他地方接觸過動物的衣服；
7、患有感冒的人員需佩戴面罩。
良好規范的操作：
1、為您的CO2培養箱建立一套日常的標準清洗程序(清潔區域需要包括培養箱周圍的區域，特別是培養箱的頂部)；
2、經常檢查實驗室的其他設備是否受到污染(例如：洗手池/離心機等)；
3、有計劃放置您的培養箱，盡量減少開門時間和不必要的移動；
4、快速開關CO2培養箱；
5、限制使用同一培養箱的人數；
6、盡快清除溢出物，之后用酒精清潔；
7、舍棄水純化系統最初得到的水。
注重培養過程：
1、細胞培養需要經常性地檢查是否被污染；
2、使用半個開放培養皿盛放組織培養基。開口放置于培養箱中1至4個小時。蓋上培養皿蓋子。37℃培養24-72小時。觀察現象。
3、早期發現污染可以提高培養物存活的幾率；
4、不要混用、共享培養皿或培養基；
5、不要令盛放培養基的容器開口放置過長時間；
6、全被污染的培養涉及物需要用高壓滅菌消毒；
7、盡量使用一次性預滅菌培養耗材。
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