pBM27 Toposmart Cloning Kit（gateway系統入門 TOPO克隆載體）

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pBM27 Toposmart Cloning Kit（gateway系統入門 TOPO克隆載體）

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BJ-PJ6527

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產品介紹：

利用痘苗病毒的拓撲異構酶I(Topoisomerase I)的切割再連接的特點將PCR產物定向克隆到線性化的pBM27載體中。適用于克隆由Pfu、sPfu、KOD、Xerox、Phusion和Q5等高保真DNA聚合酶擴增的平末端PCR產物。pBM27載體類似于invitrogen公司的pENTR/D-TOPO入門載體，具有attL1和attL2，為gateway系統中的入門載體。引物M13F(-21)和M13R可用于菌落PCR和測序鑒定。
產品特點：
（1）連接反應僅需 5 分鐘。
（2）只適合平末端 PCR 產物的快速、高效、定向克隆。
（3）載體采用了新的制備工藝，零背景，無需藍白斑篩選
（4）可在基因的 C 端中融合 Flag 標簽序列。
（5）載體為壯觀霉素抗性。
注意事項：
(1) 引物要求：PCR 引物 5’端不能進行磷酸化修飾，普通商業化引物即可。上游引物的 5’端添加 CACC 四個堿基（CACC 為真核表達所必需的 Kozak 序列）。如果目的蛋白需要在 C 端帶 FLAG 標簽，下游引物則需要去掉基因本身的終止密碼子（3 個堿基），目的蛋白的翻譯終止由 FLAG 標簽的終止密碼子 TAA（位于 Xho I 酶切位點前）來實現。
(2) DNA 聚合酶：選用 Pfu、sPfu、Phusion、Q5、KOD 和 Xerox 等高保真 DNA 聚合酶用于 PCR 擴增。
(3)連接時間：5-15 分鐘，一般為 15 分鐘。
(4)連接溫度：室溫 (22℃-37℃)，可使用PCR儀控溫。最佳反應溫度為25℃。若片段有高GC等復雜結構，可在37℃反應。
(5)產物要求：為保證PCR產物完整，建議72℃后延伸5-10分鐘。連接前使用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物的質量和純度，如PCR產物為非單一性條帶，目的片段一定要切膠回收。如PCR產物為單一條帶，無引物二聚體，可以取1-3?l的PCR產物直接連接。但若擴增模板為質粒DNA，應注意質粒的抗性。由于pBM27載體為壯觀霉素抗性，以壯觀霉素抗性的模板質粒擴增的PCR產物應切膠回收后再連接。
(6)片段用量：膠回收的DNA片段一般使用量為50-100ng。對照片段為5’端帶CACC四個堿基的全長EGFP基因的平末端產物。
(7)往M13F(-21)和M13R引物干粉管加120?l滅菌水即為5?M濃度的引物。

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